我們在做一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，需要了解的步驟與所需物品是*的。而今天，上海酶聯(lián)這里要給朋友們分享的就是實(shí)驗(yàn)制得細(xì)胞的樣本，您需做好下文中的這六步兩注意。所謂的六步兩注意也就是操作的六個(gè)步驟，和兩條注意事項(xiàng)，下面我們就來詳細(xì)的看看吧。
實(shí)驗(yàn)之前，我公司的技術(shù)人員為朋友們特別準(zhǔn)備說明了所需的物品有哪些：
1、培養(yǎng)基；不含酚紅的DMEM培養(yǎng)基
2、處理玻片：將多聚賴氨酸溶液（溶于1mol/L pH7.0 Tris-HCl緩沖液中），涂布于玻片上，干燥后即可使用。或者APES 2ml溶于100ml丙酮中，將玻片浸泡入內(nèi)，取出晾干，180℃干燥備用。
3、洗滌液；0.1M，pH7.2～7.4PBS
4、細(xì)胞固定液：4%多聚甲醛0.1MPBS(pH7.2～7.4)含有1/1000 DEPC。
5、乙醇：70% 90% 100%
6、胃蛋白酶溶液：用0.1N HCl將其稀釋為100μg/ml
7、設(shè)備：烤箱，CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，玻璃載玻片，原位雜交蓋玻片，溫箱，加樣器和吸頭等。
操作步驟：
1、在37℃ 5% CO2條件下將細(xì)胞加在處理的載玻片上，用培養(yǎng)基培養(yǎng)，時(shí)間通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定；
2、細(xì)胞長好后，用洗滌液洗2分鐘×3次，室溫下將其放入細(xì)胞固定液中固定30-60min，蒸餾水洗滌；
3、室溫下用洗滌液充分洗滌固定細(xì)胞，（干燥后-20℃冰凍保存2周以上）
4、雜交前將固定的細(xì)胞進(jìn)行如下處理；依次在70%，90%，100%的乙醇中浸泡，脫水每次5min，用二甲苯洗滌，除去殘留脂質(zhì)依次在100%，90%，70%乙醇中浸泡，進(jìn)行再水化，每次5min，zui后浸泡于洗滌液中；
5、在37℃用胃蛋白酶溶液10min處理固定的細(xì)胞，以增加細(xì)胞對大分子試劑的通透性，再用洗滌液洗5min；
6、用1%甲醛固定10min，用洗滌液洗凈。
注意！
1、所有溶液都必須用RNA酶抑制劑處理。
2、操作中重要的是及時(shí)固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對mRNA的分解作用。此外，過度固定對原位雜交有明顯的不利影響。
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